血凝血凝抑制試驗說明書

雞新城疫血凝與血凝抑制實驗

雞新城疫血凝(ha)及血凝抑制(h1)試驗

基本原理:

許多病毒表面具血凝素,具有凝集某些動物或人紅細胞的特性,稱為血凝現象,可用於鑑定病毒。血凝現象可以被特異性抗體所抑制,稱為血凝抑制現象,利用這種特性可進行血清學試驗,稱為血凝抑制試驗。器材及試劑:

待檢病毒:雞新城疫病毒雞胚尿囊液;

待檢血清:抗雞新城疫病病毒陽性血清;

生理鹽水/pbs、1%雞紅細胞、96孔v形微量血凝板、加樣器等。

實驗步驟

pbs的配製:

1%雞紅細胞的配製:

(一)血凝試驗(ha)取96孔板,按以下步驟操作:

1、第一排1-12孔各加生理鹽水50ul,第二排1-12孔加生理鹽水50ul為紅細胞對照;

2、吸50ul病毒液於第一排第1孔,混勻後取50ul至第2孔,依次稀釋至第12孔,棄去50ul,各孔經倍比稀釋後稀釋度依次為2-1~2-12。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%雞紅細胞50ul,微型震盪器震盪2min混勻。

4、室溫靜置10-30分,觀察結果(見下表)。

5、結果判定:紅細胞對照組紅細胞完全沉降,以試驗排中能使等量紅細胞發生完全凝集的病毒最高稀釋倍數,作為病毒的血凝價,即hi效價,用2n表示。

(二)四單位檢測:

(三)血凝抑制試驗(hi)

取一96孔板,按以下步驟操作:

1、4個單位抗原的製備:按ha試驗測出的病毒血凝價除以4即為4個單位血凝素的稀釋度。

2、待檢血清的稀釋:第一、二、三排1-12孔各加生理鹽水50ul,於第一排第1孔中加入50ul待檢血清,反覆吹吸3-5次混勻後,取50ul至第2孔混勻,吸取50ul至第3孔,依次稀釋至第12孔,棄去50ul,經倍比稀釋,血清的稀釋倍數為21~212。

3、第一、二排1-12孔各加4個單位血凝素50ul,微量震盪器震盪2min混勻;

4、室溫靜置20min;

5、第一、二、三排1-12孔各加1%雞紅細胞50ul,微量震盪器震盪2min混勻混勻。

6、室溫靜置10-30分,觀察結果(見下表);

7、結果判定:第二排為抗原對照,紅細胞應全部凝集,第三排為紅細胞對照,紅細胞應全部沉降。以待檢血清能完全抑制病毒凝集紅細胞的最高稀釋倍數為血清的hai效價,用2n表示。通常能使4個凝集單位病毒凝集紅細胞的作用完全被抑制的血清最高稀釋倍數,稱為抗體的血凝抑制價(hi效價)。只有陰性對照孔血清滴度不大於21g2,陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度,試驗結果才有效。